طقم اختبار بيروكسيداز إليسا المضاد للغدة الدرقية ، أطقم اختبار الأجسام المضادة TPO

مجموعة إليسا المضادة لبيروكسيداز الغدة الدرقية المضادة لـ TPO

1. الاستخدام المقصود

المقايسة المناعية للتحديد الكمي في المختبر للأجسام المضادة لبيروكسيداز الغدة الدرقية في مصل الدم البشري.يستخدم تحديد مضادات ‐ TPO كعامل مساعد في تشخيص أمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية.

2. ملخص 

• يوجد البيروكسيديز الخاص بالغدة الدرقية (TPO) على ميكروسومات الخلايا الدرقية ويتم التعبير عنه على سطح الخلية القمي.بالتآزر مع ثيروجلوبولين (Tg) ، فإن هذا الإنزيم له وظيفة أساسية في إضافة اليود إلى L ‐ tyrosine والاقتران الكيميائي الناتج عن mono‐ و di iodotyrosine لتشكيل هرمونات الغدة الدرقية T4 و T3 و fT3.
• TPO هو مستنبط ذاتي محتمل.تم العثور على التتر المصل المرتفع للأجسام المضادة لـ TPO عدة أشكال من التهاب الغدة الدرقية التي تسببها المناعة الذاتية.مصطلح "الجسم المضاد الميكروسومي" الذي لا يزال موجودًا بشكل متكرر نشأ من الوقت الذي لم يتم فيه تحديد TPO كمستضد في المناعة الذاتية التي تسببها الميكروسومات.بالمعنى السريري ، يمكن استخدام المصطلحين anti‐ TPO والجسم المضاد الميكروسومي بشكل مترادف ؛ومع ذلك ، هناك اختلافات فيما يتعلق بطرق الاختبار.
• تم العثور على نسبة عالية من مضادات ‐ TPO في ما يصل إلى 90٪ من مرضى التهاب الغدة الدرقية المزمن في هاشيموتو.في مرض جريفز ، يعاني 70٪ من المرضى من ارتفاع في العيار.على الرغم من أنه يمكن زيادة حساسية الإجراء عن طريق التحديد المتزامن للأجسام المضادة للغدة الدرقية (الأجسام المضادة Tg و TSH مستقبلات ‐ - TRAb) ، فإن النتيجة السلبية لا تستبعد احتمال الإصابة بأمراض المناعة الذاتية.لا يرتبط حجم عيار الجسم المضاد بالنشاط السريري للمرض.يمكن أن يصبح التتر المرتفع في البداية سالبًا بعد فترات طويلة من المرض أو أثناء مغفرة.إذا ظهرت الأجسام المضادة مرة أخرى بعد مغفرة ، فمن المحتمل حدوث انتكاس.
• في حين أن اختبارات الأجسام المضادة الميكروسومية المعتادة تستخدم ميكروسومات غير نقية كمستحضر مستضد ، فإن اختبارات مضادات ‐ TPO تستخدم بيروكسيداز منقى.الإجراءان لهما أداء مشابه من حيث الحساسية السريرية ، ولكن يمكن توقع تناسق أفضل من الدفعة إلى الدفعة وخصوصية سريرية أعلى من اختبارات مكافحة TPO بسبب الجودة العالية للمستضد المستخدم.تستخدم مقايسات الممتز المناعي المرتبطة بالإنزيم مستضد بشري و الأجسام المضادة IgG للأرنب (مضادات IgG).

3. مبدأ الاختبار

الطريقة غير المباشرة ، المدة الإجمالية للمقايسة: 70 دقيقة.

يستخدم Anti-TPO ELISA طور صلب ، طريقة ELISA غير مباشرة للكشف عن الأجسام المضادة لـ TPO في إجراء حضانة من خطوتين.شرائح البوليسترين الدقيقة مغلفة مسبقًا بمستضدات TPO البشرية عالية التأثير المناعي.أثناء خطوة الحضانة الأولى ، سوف ترتبط الأجسام المضادة الخاصة بمضادات TPO ، إن وجدت ، بمولدات المضاد TPO المطلية مسبقًا بالطور الصلب.تُغسل الآبار لإزالة بروتينات المصل غير المربوطة ، وتُضاف الأجسام المضادة IgG المضادة للإنسان في الأرانب (المضادة لـ IgG) المرتبطة بإنزيم الفجل الحار بيروكسيديز (HRP- المتقارن).أثناء خطوة الحضانة الثانية ، سترتبط هذه الأجسام المضادة المقترنة بـ HRP بأي معقدات للأجسام المضادة (IgG) تكونت مسبقًا ثم تتم إزالة اقتران HRP غير المنضم عن طريق الغسيل.تتم إضافة محاليل الكروموجين التي تحتوي على Tetramethylbenzidine (TMB) وبيروكسيد اليوريا إلى الآبار وفي وجود مركب مناعي ضد الأجسام المضادة لـ IgG (HRP) ، يتم تحلل الكروموجينات عديمة اللون بواسطة اقتران HRP المرتبط بمنتج أزرق اللون.يتحول اللون الأزرق إلى اللون الأصفر بعد إيقاف التفاعل مع حامض الكبريتيك.

يمكن قياس مقدار كثافة اللون ويتناسب مع كمية الجسم المضاد الملتقطة في الآبار ، وكمية الجسم المضاد في العينة على التوالي.

4. الكواشف المواد المقدمة

• صفيحة ميكروسكوبية مطلية ، 8 × 12 شريط ، 96 بئراً.مغلفة مسبقًا بمستضد TPO البشري.

• أجهزة معايرة ، 6 قوارير ، 1 مل لكل منها ، جاهزة للاستخدام ؛التركيزات: 0 (A) ، 25 (B) ، 50 (C) ، 100 (D) ، 250 (E) و 500 (F) IU / mL.

• إنزيم متقارن ، قارورة واحدة ، 11.0 مل من HRP (بيروكسيديز الفجل) المسمى بالأجسام المضادة IgG المضادة للإنسان في الأرانب (مضاد IgG) في محلول Tris-NaCl الذي يحتوي على BSA (ألبومين مصل البقر).يحتوي على 0.1٪ مادة حافظة ProClin300.

• Serum Diluent: قارورة واحدة ، 11 مل.تحتوي على أملاح عازلة وصبغة

• محلول غسيل مركز ، قارورة واحدة ، 25 مل (40X مركز) ، محلول غسيل PBS-Tween.

• مادة سفلية ، قارورة واحدة ، 11 مل ، جاهزة للاستخدام ، (رباعي ميثيل بنزيدين) TMB.

• إيقاف المحلول ، قارورة واحدة ، 6.0 مل من 1 مول / لتر حامض الكبريتيك.

• IFU ، 1 نسخة.

• غطاء الطبق: 2 قطعة.

المواد المطلوبة (لكن لم يتم توفيرها)

• قارئ صفيحة ميكروسكوبية بقدرة امتصاص بطول موجي 450 نانومتر و 620 نانومتر.

• غسالة ميكروسكوبية.

• حاضنة.

• شاكر لوحة.

• الماصات الدقيقة والماصات الدقيقة متعددة القنوات توفر 50 ميكرولتر بدقة أفضل من 1.5٪.

• ورق ماص.

• ماء مقطرة

5. إجراء الاختبار

• استخدم فقط عدد الآبار المطلوبة وقم بتهيئة آبار الصفيحة الدقيقة لكل معايرة وعينة ليتم معايرتها.

• أضف 100 ميكرولتر من أجهزة المعايرة إلى كل بئر.

• أضف 100 ميكرولتر من عينة المخفف (اللون الأخضر) لكل بئر باستثناء آبار المعاير.

• أضف 10 ميكرولتر من العينة إلى كل عينة بئر مخفف (ملاحظة: ستتحول الكواشف الموجودة في الآبار إلى اللون الأزرق من الأخضر) ، ثم رجها لمدة 30 ثانية.

• قم بتغطية الطبق بغطاء لوحة واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

• تخلص من محتويات الصفيحة الدقيقة عن طريق الصب أو الشفط.في حالة الصب ، اضغط على اللوح وجففه بورق ماص.

• أضف 350 ميكرولتر من محلول الغسيل والصب (الصنبور والصبغ) أو نضح.كرر 4 مرات إضافية ليصبح المجموع 5 غسلات.في نهاية الغسيل ، اقلب اللوحة واضغط على أي محلول غسيل متبقي على ورق ماص.

• أضف 100 ميكرولتر من الإنزيم المتقارن ،

• قم بتغطية الطبق بغطاء لوحة واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

• أضف 350 ميكرولتر من محلول الغسيل والصب (الصنبور والصبغ) أو نضح.كرر 4 مرات إضافية ليصبح المجموع 5 غسلات.في نهاية الغسيل ، اقلب اللوحة واضغط على أي محلول غسيل متبقي على ورق ماص.

• أضف 100 ميكرولتر من الركيزة إلى كل بئر.يغطى ويحضن في درجة حرارة محيطة (18-25 ℃) في الظلام للتفاعل لمدة 10 دقائق.لا تهز اللوحة بعد إضافة فرعية.

• أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف لكل بئر.

• رجّ لمدة 15-20 ثانية لخلط السائل داخل الآبار.من المهم التأكد من أن اللون الأزرق يتغير إلى اللون الأصفر تمامًا.

• اقرأ امتصاص كل بئر عند 450 نانومتر (باستخدام 620 إلى 630 نانومتر كطول موجي مرجعي لتقليل عيوب البئر) في قارئ لوحة ميكروية.يجب قراءة النتائج في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف.